首页 -> 2006年第6期
分子生物学实验课的改革与探索
作者：郝福英 文 津 李 茹
分子生物学实验课是生命科学学院本科生重要的实验课之一，目前我们采取以每一个实验为单位，实验与实验间相互独立的授课方式。这样的教学突出实验技术的本身，而学生上完课后不能完全掌握知识的连贯性，遇到课题时不清楚何时运用和怎样运用这些技术解决问题。
改革后分子生物学大实验给定一个题目，由学生自主设计一个全新的教学实验流程，改变以前分子生物学各实验之间割裂无联系的状况，使综合实验更具有自主性、趣味性，更有利于培养学生的科研能力的培养，包括口头表达能力和写作能力。综合性实验包含了实验室现有的分子生物学实验技术，各个实验之间紧密相连，每一部分实验结果都会直接影响最后的实验结果，这样学生都很有责任感。当他们通过每一步的不懈努力，最后观察到预期的实验成果时，学生非常有自信和成就感。改革后分子生物学实验包括以下十个步骤：
一、给定题目
在实验开始前一周举行报告会，内容包括：目前分子生物学实验的现状，本次实验课改革的意义以及实验题目——绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达。
二、明确实验室提供的条件
1．最初始的两个质粒pEGFP-N3质粒，pET—28a质粒。
2．完成题目的仪器设备，试剂(学生提计划)。
三、根据现有的知识和技能来设计进行实验
1．学生首先资料查询两个质粒的特点
pEGFP-N3质粒编码野生型GFP的红移(荧光波长较大)变异体蛋白，具有更强的荧光(在485nm激发下比野生型强35倍)和在哺乳动物细胞中有较好的表达。激发峰在488nm，发射峰在507nm。
pET-28a质粒载体上面携带一个N-terminal His Tag／Thrombin／T7 tag结构以及一个可以选择的C-terminal HisTag。克隆表达区域的编码框由T7RNA聚合酶转录。
2．根据查询的资料，确定两种途径可以到达目标
第一种方法用限制性内切酶方法，如果选定内切酶的方式去做实验，如何选择内切酶，选哪种内切酶即合用又经济。
根据两个质粒结构的特点学生要在多种内切酶中进行选择，考虑pEGFP片段完整又考虑到被克隆的目标载体表达区域的编码框正确性。在经过比对和讨论后决定使用Notl酶，Bamhl酶，这是一对最合适的内切酶。
第二种方法用PCR基因扩增方式达到目的。如果用PCR方法去做实验，必需根据pEGFP的序列设计引物，通过资料查询得知pEGFP的序列如下：
根据分子生物学设计原则，设计扩增GFP基因的引物，再经过计算机软件查询设计引物的合理性。结果得出如下一对引物：
F——GCATATGGTGAGCAAGGGCGA
R——GGGATCCCTI'GTACAGCTCGTC
Tm=56
四、学生提交设计方案后得出如下结论
1．GFP的应用特点
检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
2．实验题目包含的内容
本实验的目的是通过BamH I和Not I两种限制性内切酶的消化把EGFP基因从pEGFP-N3质粒中克隆出来，或者用PCR方法把EGFP基因从pEGFP—N3质粒中扩增出来。并定向插入到表达载体pET-28a质粒的多克隆位点(MCS)中，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，在IPTG的诱导下表达出带有N端His-Tag的融合蛋白。表达了GFP的菌体在离心管中呈黄绿色，在紫外光激发下发射出特异的绿色荧光，证明了目的蛋白的成功表达。另外在菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳图谱中出现了明显的诱导条带，且条带中蛋白浓度与诱导时间呈正相关。随后的Western Blotting免疫反应进一步确证此条带代表的蛋白质正是带有His-Tag的融合蛋白。
五、学生完全自主地设计安排实验进程和步骤
根据前一段资料查询，学生提交GFP蛋白的基因克隆及表达实验设计方案，他们将实验整体思路、每一个实验步骤及方法、预期的实验结果、使用的试剂和材料、具体的时间安排等，都列出详尽的计划，以便有条不紊地进行实验。
分子生物学综合实验整体流程：
六、以班级为单位报告实验结果
由于全班20个组分别做实验，会出现各种各样的问题和实验现象，每个学生能力和参加科研组训练的背景不同，因此交流报告会尤为重要．在报告会上学生把实验中的各种问题提出来共同讨论，他们运用所学知识解释实验现象，语言表达明确，图文并茂力求说服别人，因此报告会达到互相交流互相学习的目的，提高了学生的口头表达能力。
七、用论文的格式来完成实验报告
科学论文的写作需要经常性训练，如果本科生实验课的实验报告采用科学论文形式完成，是一种非常好的办法，分子生物学综合实验为训练学生书写和完成科学论文提供了内容和条件。以下是实验结束后学生提交的完成实验报告。
八、实验结束后学生的反映及提出的建议
1．学生感想
本次实验提供了系统的分子生物学操作的机会，从基因的克隆，载体的构建到蛋白的表达与鉴定，我们在实验过程中重新梳理了实验思路并独立进行实验设计，进一步掌握了分子实验操作技术和原理。由于采用了组内协作组间讨论的实验方式，各个实验室，不同科研试验背景的同学得以互相交流，取长补短，扩大了知识面，培养了互相学习合作的精神并且增强了同学间的科研气氛。
这样的实验模式令我们耳目一新：老师给出题目，让我们自己进行实验设计，设计内容包括思路、步骤、九天的整体策划和安排。从开始进行实验，所有这一切过去都是老师替我们做好，现在轮到我们自己做的时候才发现了它的困难和复杂。当然，亲自实验，锻炼了我们的分析力和设计能力，尤其是实验失败后得到了很大的提高。
2．学生建议
可以选取多种目的蛋白，由学生自己选择进行克隆表达，更能增强实验的探索性和趣味性。希望能够把这个实
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