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顾锡畴，字九畴，昆山人。十三岁的时候，以诸生身份参加南京的考试，魏国公将女儿许配给他。考取万历四十七年(1619)进士，改任庶吉士，授职为检讨。
天启四年(1624)，魏忠贤的势力嚣张，顾锡畴与给事中董承业负责福建的考试，科举的示范文章大加讥讽。魏忠贤的党羽指责他们是东林党人，两人被一起降职。最后，被削夺官籍。
崇祯初年，又召见他，官复原职。升任国子监祭酒。奏请恢复积分法，礼官阻挠不让施行。顾锡畴又申诉此事，并请求选择监生担任州县长官。此后，奏请订正陪祭祀者的位次，担当国子博士的进士能参与考核、录用。皇帝都同意了。探亲回乡，请求在家乡度过一生。母亲的丧期满后，起用为少詹事，晋升詹事，加封礼部左侍郎，负责部中事务。皇帝曾经召见他面商国事，询问理财用人的问题。顾锡畴告退后，陈述了用人方面的五点失误，称：“考察选官没有法度，文网太严峻，议论太多，太拘泥于资格，对人没有鼓动作用。请使先用人的地方一一清正源流。精心鉴别，依照才能任用，这是好处一。赦免小过失而不完全废弃，这是好处二。减少议论而专门责其成事之效这是好处三。选择奇异的人材而不拘泥于平常的规章，这是好处四。积极奖励而宽缓督察、责备，这是好处五。”最后极力陈述耗靡钱财的弊端，仍然归其根源在于用人。皇帝对他的奏疏称好。
杨嗣昌奏疏请求招抚流寇，其中有“乐天者保天下”和“善战者服上刑”的话。顾锡畴争辩，称这是诸侯间交战的事情，引用不合伦理，与杨嗣昌相违逆。杨嗣昌主持政务，诸位言官都攻击他，杨嗣昌很怀疑顾锡畴。遇上驸马都尉王籨犯罪，顾锡畴准备从轻发落，杨嗣昌诬陷他，便削夺了他的官籍。崇祯十五年(1642)，朝廷大臣交相举荐，皇帝召他回朝。御史曹溶、给事中黄云师又称不应该任用他。皇帝不听，任命他为南京礼部左侍郎。
福王立位，他晋升为本部尚书。当时尊奉福恭王为恭皇帝，准备商议庙祀，顾锡畴奏请另外设立专门的庙宇。不久，请求增补建文帝的庙祀谥号、景皇帝的庙号和建文朝忠臣的赠封与谥号，皇帝都依从了他。东平伯刘泽清称“：宋高宗在南京即位，立刻在靖康二年(1126)五月确立建炎纪元，遵从民众的愿望。我请求从今年五月改为弘光纪元。”顾锡畴明确地说诏令已经颁布，不能追悔更改，才作罢。当时确定大行皇帝的庙号为思宗，忻城伯赵之龙称“思”不是美称，引经据典核证，顾锡畴也认为如此，上奏请求更改。大学士高弘图因为前面的提议是自己提出的，极力坚持，于是事情沉寂。温体仁去世，特别谥号文忠，而文震孟、罗喻义、姚希孟、吕维祺都没有获得谥号。顾锡畴称：“温体仁获得皇帝信任，行使政令最为专横而且长久，他对先帝所负的罪最大而且深重，请求将文忠谥号，或者删削或者更改，而增补文震孟等大臣的谥号，使普天下奖惩有度。”答复可以。于是增补诸臣的谥号，剥夺了温体仁的谥号。
吏部尚书张慎言离职，顶替的人徐石麒没有到任，皇帝命令顾锡畴负责事务。当时马士英掌握国政，顾锡畴一向与他不和。给事中章正宸、熊汝霖弹劾他，于是他请求到南海去祭祀而离去。第二年春天，御史张孙振极力颂扬温体仁的功绩，请求恢复他原来的谥号。便勒令顾锡畴退休。
南都失守，顾锡畴的乡里也被攻占。当时正遭遇父亲的丧期，他由小路赴福建。唐王命令他就任原职，他极力推辞，在温州江心寺寓居。总兵贺君尧鞭挞侮辱诸生，顾锡畴打算对他进行弹劾。贺君尧乘夜色派人杀害了他，将尸体投入江中。温州人寻找了多天，才将他入棺葬殓。
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